Método sencillo para la síntesis de bisfosfonatos geminales

Appearance of bone metastases is the most common complication of oncological diseases. They are usually incurable, produce severe pain, decreasing the expectancy and quality of life of patients. The use of radiopharmaceuticals for bone metastatic pain palliation have shown significant advantages. Bisphosphonates are the main compounds employed for that purpose; nevertheless, their synthesis is relatively a complex process. The aim of the present work was to develop a method for the synthesis of geminal bisphosphonates, starting from the respective amino acids. A three-steps way of synthesis was stablished for the obtainment of such compounds: 1) protection of amino group of the starting amino acid, 2) phosphonation and subsequent hydrolysis of the protected amino group and 3) obtainment of sodium salt. Three different procedures for the protection of amino and hydroxyl groups of the starting amino acids were tested. The use of acylation reaction with formic acid and acetic anhydride, before phosphonation, improved practical conditions for the synthesis of respective bisphosphonates with satisfactory yields. Thus, four bisphosphonic acids, non-previously reported in consulted literature, were synthetized. They were characterized by infrared spectroscopy and NMR. INTRODUCCIÓN Los bisfosfonatos son moléculas que presentan una elevada afinidad por el tejido óseo y se dirigen específicamente a los lugares de formación o resorción del mismo. Se caracterizan por tener dos enlaces carbono-fósforo, que le Anaís Prats-Capote, Alejandro Perera-Pintado, Raúl Mocelo-Castell*, Yoel GriffithPérez**, Marisé García-Batlle***, Beatriz O ́Reilly-Dueñas*, Osmar CalderónSánchez*, Rafaela Pérez-Perera Chryslaine Rodríguez-Tanty***** Dirección de Investigaciones Clínicas, Centro de Isótopos, Calle 34 #4501 entre 45 y 47, Reparto Kholy, Playa, Habana, CP 11300, Cuba. Facultad de Química, Universidad de La Habana, Zapata s/n entre G y Carlitos Aguirre, Vedado, Plaza de la Revolución, La Habana, CP 10400, Cuba. Centro de Aplicaciones Tecnológicas y Desarrollo Nuclear, Calle 30 #502 e/ 5ta y 7ma Avenida, Playa, La Habana, CP 11300, Cuba. ***Instituto Superior de Ciencias y Tecnologías de Avanzadas, Ave. Salvador Allende No. 1110 e/Infanta y Ave. Boyeros, Plaza de la Revolución, La Habana, Código Postal: 10400, Cuba. ****Departamento de Biología Molecular, Centro de Neurociencias de Cuba, Avenida 25, No. 15202, esquina a 158, Playa, La Habana, CP 11300, Cuba. [email protected] Revista CENIC Ciencias Químicas, Vol. 47, pp. 34-42, 2016. 35 confieren a la molécula una elevada resistencia a la hidrólisis enzimática y le permiten enlazarse fuertemente a la hidroxiapatita de la matriz ósea. Los bisfosfonatos geminales han sido ampliamente utilizados para el tratamiento de enfermedades del sistema osteoarticular como la osteoporosis y la enfermedad de Paget, entre otras. Su empleo en pacientes con metástasis óseas permite disminuir el dolor y reducir el número de fracturas asociadas a esta patología, retrasa la progresión de la afección y disminuye la necesidad de otras intervenciones como radioterapia, el uso de opiáceos o cirugía ortopédica. Se ha observado un incremento en su efecto, cuando se administran concomitantes con las radiaciones, la quimioterapia o la terapia hormonal. En los últimos años se ha incrementado el empleo de radiofármacos para la terapia paliativa del dolor producido por las metástasis óseas, gracias a las múltiples ventajas que ofrecen. Estas razones han incidido en considerar la marcación de los compuestos bisfosfonatos geminales con radionucleidos emisores de partículas ionizantes, como una alternativa para potenciar su efecto terapéutico. Por esta razón, en el mundo continúan los trabajos encaminados a la obtención de nuevos radiofármacos basados en este tipo de producto. Sin embargo, los métodos de síntesis de bisfosfonatos, reportados hasta el momento, son complejos. El objetivo del presente trabajo fue desarrollar un método de síntesis de bisfosfonatos geminales partiendo de los aminoácidos respectivos. MATERIALES Y MÉTODOS Reactivos y disolventes Todos los reactivos y disolventes empleados fueron de calidad puros para síntesis. El anhídrido acético puro se destiló previo a su utilización. El xileno empleado se secó con tamices moleculares de 3Å, los cuales fueron activados previamente en un horno de microondas doméstico. Los aminoácidos de partida se secaron en una pistola de secado con P2O5 al vacío durante 72 horas. Determinación del avance de la reacción y métodos de purificación de los productos El avance de la reacción y la pureza de los productos obtenidos se verificaron mediante cromatografía de capa delgada (CCD). Se utilizaron placas pre-elaboradas de gel de sílice con indicador fluorescente a 254 nm, de 5x10 cm y 0.25 mm de grosor. Las fases móviles empleadas fueron n-butanol: ácido acético: agua (4:1:1 v/v/v) y cloroformo: metanol (4:1 v/v). Los productos obtenidos se purificaron por recristalización en los sistemas acetona: metanol (1:1 v/v) o acetona. La pureza del ácido bisfosfónico se determinó mediante el ensayo de azul de moliddeno. Para ello se emplearon tiras de papel Whatman No. 4 de 5x10 cm como fase estacionaria y como fase móvil el sistema cloroformo: metanol (10:3 v/v). El revelado se realizó asperjando las tiras de papel con dos disoluciones por separado, esperando 10 min entre cada aspersión. Dichas soluciones fueron: A) molibdato de amonio al 1 % en HCl 3 mol/L y B) ácido ascórbico al 1% en agua (preparado al momento de usarse). Caracterización de los productos obtenidos Las distancias relativas al frente del disolvente (Rf) de los productos obtenidos se calcularon y reportaron para las diferentes fases móviles y soportes en que se realizaron las cromatografías. Las temperaturas de fusión (Tf) se determinaron en un equipo Electrothermal, modelo 9100 en capilares abiertos y no fueron corregidas. Los espectros infrarrojos se registraron de 500 a 4000 cm en un espectrofotómetro FT/IR JASCO, con resolución de 4 cm. Las muestras se prepararon en pastillas de KBr a temperatura ambiente, utilizando la técnica estándar. Los espectros RMN-H y RMN-C se registraron en equipos Bruker AC-250 y Bruker AM-300 (250 MHz – H: 62.0 MHz – C), utilizando como referencia interna tetrametilsilano (TMS). Los disolventes empleados en los registros fueron DMSO-d6 y D2O. Síntesis de los ácidos bisfosfónicos Se emplearon los L-aminoácidos siguientes como reactivos de partida para obtener los correspondientes ácidos bisfosfónicos geminales: tirosina, fenilalanina, triptófano e histidina. Protección de los grupos aminos e hidroxilo de los aminoácidos Técnica A. En un matraz de fondo redondo de destilación de tres bocas, con agitación magnética, se añadieron 27 mmoles del aminoácido correspondiente y 20 mL de una disolución 1 mol/L de hidróxido de sodio. Muy lentamente se adicionaron, a través de sendos embudos goteadores, 1.48 moles de cloroformiato de metilo y 200 mL de una disolución 4 mol/L de hidróxido de sodio, de forma tal que el pH se mantuviera entre 9 y 9.5. La mezcla de reacción se enfrío hasta 0°C y se realizaron tres extracciones con 10 mL de éter etílico. El pH de la fase acuosa se ajustó a 1 con ácido fosfórico concentrado (85%), y luego se saturó con cloruro de sodio. Se realizaron 4 Revista CENIC Ciencias Químicas, Vol. 47, pp. 34-42, 2016. 36 extracciones con porciones de 10 mL de diclorometano. La fase orgánica se secó con sulfato de magnesio anhidro y, posteriormente, se evaporó al vacío para obtener el compuesto deseado. Técnica B. En un matraz de fondo redondo de dos bocas, con agitación magnética, se adicionaron 55 mmoles de p-formaldehido y 55 mmoles de anhídrido acético. La agitación se mantuvo durante 30 minutos. Posteriormente, se le añadió 30 mmoles del aminoácido correspondiente y se agitó la disolución durante una hora a temperatura ambiente (TA). Una vez concluida la reacción, la mezcla reaccionante se neutralizó con hidróxido de sodio (1 mol/L) y luego se le adicionó metanol para que precipitara el compuesto protegido. Los compuestos se filtraron al vacío y se secaron en una pistola de secado con P2O5 al vacío durante 72 horas. Técnica C. En un matraz de fondo redondo de dos bocas, con agitación magnética, se adicionaron 55 mmoles de ácido fórmico (98%) y 55 mmoles de anhídrido acético. La agitación se mantuvo durante 30 minutos. Posteriormente, se añadieron 30 mmoles del aminoácido correspondiente y se reflujó la disolución durante 1 hora. La mezcla reaccionante se neutralizó con hidróxido de sodio (2 mol/L) y luego se le adicionó metanol para precipitar el compuesto protegido. Los compuestos se filtraron al vacío y se secaron en una pistola de secado con P2O5 al vacío durante 72 horas. Fosfonación e hidrólisis En un matraz de fondo redondo de dos bocas, con agitación magnética, se adicionaron 24 mmoles de ácido fosforoso, 24 mmoles de pentacloruro de fósforo y 2 mL de xileno (como disolvente). Se mantuvo la agitación durante 15 min (reacción exotérmica). Se dejó enfriar y se le añadió 24 mmoles del aminoácido protegido. La mezcla de reacción se reflujó durante 5 horas a 100°C con agitación. Pasado este tiempo, la mezcla reaccionante se dejó enfriar hasta temperatura ambiente, se le añadió 2 mL de agua y se dejó con agitación constante durante 2 horas. Se realizaron tres extracciones sucesivas con acetato de etilo. La fase orgánica se secó con sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se concentró por rotoevaporación. Se adicionó 10 mL de eterdietílico y se guardó a -20oC para la precipitación del producto final. Se sintetizaron 4 productos: ácido 2-amino-3-(4-hidroxifenil)-1-hidroxipropil-1,1-bisfosfónico, ácido 2-amino-3-(4Hindol)-1-hidroxipropil-1,1-bisfosfónico, ácido 2-amino-3-(4H-imidazol)-1-hidroxipropil-1,1-bisfosfónico, ácido 2amino-3-fenil-1-hidroxipropil-1,1-bisfosfónico. Obtención de las sales sódicas a partir de los correspondientes ácidos bisfosfónicos A un matraz de fondo redondo de 25 mL, se le añadió 6.4 mmoles del bisfosfonato correspondiente y 5 mL de una disolución de hidróxido de sodio (2 mol/L). La disolución obtenida con pH superior a 8, se agitó durante 15 min y luego se se concentró por roto evaporación hasta sequedad para adicionar 5mL de acetona. El sólido que se forma se filtró al vacío, se lavó con acetona y se secó en pistola con pentóxido de difósforo. RESULTADOS Y DISCUSIÓN La secuencia P-C-P confiere a los bisfosfonatos geminales, no solo una elevada resistencia a la hidrólisis enzimática, sino una incorporación adecuada al esqueleto, de lo cual se han derivado sus múltiples aplicaciones en medicina. No obstante, entre ellos muestran diferencias en cuanto a su afinidad por el tejido óseo. Estudios de relación estructura-función de los bisfosfonatos sugieren que la adición de un grupo hidroxilo en el primer átomo de carbono, así como la presencia de grupos amino terminales incrementa la capacidad de unión a la matriz ósea de dichos compuestos y su actividad regenerativa. La alta afinidad de este tipo de moléculas por la matriz ósea, con una incorporación a la misma proporcional a su actividad metabólica, unido a su rápida excreción por vía urinaria; los coloca como una alternativa interesante para desarrollar radiofármacos potencialmente útiles para la terapia paliativa del dolor por metástasis óseas. Diferentes isótopos radioactivos emisores de partículas  y , formando parte de distintas sustancias, se han empleado en el tratamiento paliativo del dolor producido por metástasis óseas. Hasta el momento, todos los radiofármacos actuales presentan ventajas y desventajas, relacionadas con las propiedades físico-nucleares de los radioisótopos, los efectos de mielosupresión y los altos precios o la disponibilidad en el mercado. En este sentido se propone el desarrollo de un radiofármaco potencialmente útil para la paliación del dolor por metástasis óseas, que pueda ser marcado con I. Este radionucleido, por sus características nucleares y disponibilidad en el mercado a bajos precios, unido a su química conocida, resulta muy atractivo para estos fines. Por ese motivo, se decidió la síntesis de bisfosfonatos geminales a partir de aminoácidos aromáticos, moléculas que cumplirían con tener la presencia de un grupo hidroxilo en el primer carbono, un grupo amino terminal, y, además, un anillo aromático que facilitaría su marcaje posterior con I. Del análisis de los diferentes métodos convencionales de síntesis de bisfosfonatos, se desprende que la mayoría tiene el inconveniente de los largos tiempos de reacción, que oscilan entre 12 y 36 h, y en algunos casos implica el Revista CENIC Ciencias Químicas, Vol. 47, pp. 34-42, 2016. 37 empleo de más de un método para la obtención del producto final. Sin embargo, los métodos de fosfonación directa de grupos carboxílicos sólo transcurren en uno o dos pasos, con tiempos de reacción menores. La ruta sintética propuesta partió del análisis de la síntesis propuesta por Hun W. y colaboradores. La misma constó de dos pasos: 1) la protección de los grupos amino e hidroxilos de los aminoácidos de partida, previa a la fosfonación y 2) la obtención del bisfosfonato. Protección de los grupos aminos e hidroxilos de los aminoácidos En la técnica A se siguió la metodología patentada por Hun W. y cols. para la protección del grupo amino de la βalanina. Este procedimiento presentó los siguientes inconvenientes prácticos:  El pH de la reacción debía mantenerse constante en un rango entre 9.0 9.5, pues de lo contrario se formaba un precipitado blanco, correspondiente a la sal N-alcoxicarbonilo del aminoácido correspondiente. Una vez formada la sal, resultaba imposible revertir el proceso.  Para lograr mantener el rango de pH, se requería del uso de un elevado volumen de disolución de hidróxido de sodio.  La temperatura de trabajo debía oscilar entre 0 y 5 °C. En caso de aumentar, precipitaba la sal correspondiente. Estas dificultades, unido a la toxicidad resultante del trabajo con cloroformiato de metilo, obligaron a buscar otras variantes para la protección de los grupos amino e hidroxilo, manteniendo el segundo paso (fosfonación), tal como se expone en la patente de Hun W. y colaboradores. Para la protección del grupo amino se empleó un anhídrido mixto como agente protector mediante una reacción de aminólisis. El anhídrido mixto se obtuvo a través de dos procedimientos diferentes (Técnica B y Técnica C). En la Técnica B, el anhídrido mixto se obtuvo a partir de la reacción entre el p-formaldehído y el anhídrido acético. Teóricamente, la reacción de formación del anhídrido debe ocurrir in situ. Sin embargo, este método presentó como inconveniente fundamental, que en él se observó la solidificación de la mezcla de reacción con una coloración carmelita oscuro, lo cual debe corresponder a la polimerización del p-formaldehído, por lo que no se obtuvieron rendimientos satisfactorios. En la Técnica C, el anhídrido mixto se obtuvo a partir de una reacción de acidólisis entre el ácido fórmico (I) y el anhídrido acético. La reacción ocurre por el ataque nucleofílico del oxígeno del grupo hidroxilo del ácido fórmico sobre el átomo de carbono carbonílico del anhídrido acético, para formar un anhídrido mixto y ácido acético. Esta reacción es casi irreversible, debido a que el ácido acético formado es un ácido más débil que el ácido fórmico y es poco probable el ataque del mismo sobre el carbono carbonílico del anhídrido mixto. El anhídrido mixto posee un carbono carbonílico más electrofílico que el anhídrido acético, debido a la ausencia del grupo metilo con un efecto inductivo +I sobre el mismo, que disminuye su electrofilia, favoreciéndose de esta forma el ataque nucleofílico del grupo amino sobre dicho carbono, dando lugar a la formamida y el ácido acético correspondientes. La protección del grupo hidroxilo se realizó mediante una reacción de sustitución nucleofílica acídica, en la cual ocurre el ataque nucleofílico del par de electrones del hidroxilo sobre el carbono más electrofílico del anhídrido mixto. Los productos se obtuvieron en forma de aceite, debido a la presencia del ácido acético, el cual quedó ocluido en la amida formada. Para eliminar el ácido acético se añadió una disolución de hidróxido de sodio (1 mol/L) con el fin de transformarlo en la sal correspondiente, acetato de sodio, que, al añadir metanol al sistema permanece en solución, mientras los aminoácidos protegidos puros precipitan. Los rendimientos obtenidos oscilaron entre el 75% y el 80%, superiores a los obtenidos por otros autores, que emplearon un cloroformiato de alquilo en medio básico para la protección del grupo amino y a los obtenidos por la Técnica B, por lo que se propone esta variante para la protección del grupo amino. Las amidas son compuestos relativamente estables, que pueden ser purificados de forma sencilla y ser desprotegidas mediante calentamiento en soluciones fuertemente ácidas o básicas. De forma general, la acilación constituye una estrategia atractiva, pues resultó el método más sencillo y no requirió condiciones de reacción especiales, lo que posibilitó obtener buenos rendimientos (75-80%) de los compuestos protegidos. Caracterización espectroscópica En los espectros IR de los aminoácidos protegidos, en general, apareció una señal ancha en 3100 cm y 3500 cm, correspondiente a la vibración de valencia OH del grupo carboxilo. Alrededor de 1660 cm se apreció una señal intensa, característica de la vibración correspondiente al grupo amido. En los aminoácidos que presentan anillos aromáticos se destaca la presencia del patrón de fenilo de 1470 cm hasta, aproximadamente, 1610 cm. Según los datos que nos brindan los espectros RMN-H, en la mayoría de los aminoácidos, se observó en la zona de 7.08 a 7.21 ppm, las señales correspondientes a los protones de la región aromática y en 2.0 y 8.0 ppm aparecieron los correspondientes a los de los grupos hidroxilo y amida, respectivamente. Revista CENIC Ciencias Químicas, Vol. 47, pp. 34-42, 2016. 38 En la zona alifática del espectro RMN-C, aparecieron dos señales correspondientes a los carbonos de los grupos metileno y metino de los compuestos, siendo más blindada la de los carbonos metínicos. En la región de 115.0 ppm a 136.0 ppm se apreciaron las señales del carbono aromático, siendo más blindada la del carbono en posición orto producto al efecto electrónico del grupo sustituyente. De 160.0 ppm a 200.0 ppm se observaron las señales de los carbonos de los grupos carbonilos de la molécula. N,O-diformiltirosina